Muzeum sídlí v části dochovaného městského opevnění ze 14. – 16. století s barokním sálem pocházejícím z let 1690 – 1693. Stálá expozice Komenský lidstvu, věnovaná životu a dílu významného rodáka, je doplněna o expozici regionální historie a etnografie s názvem Starožitnosti Uherskobrodska. Mimo tyto expozice muzeum spravuje expozici Pamětní síň JUDr. Václava hraběte z Kounic na Panském domě v Uh. Brodě a etnografickou expozici Rolnický dům a hospodářství ve Vlčnově. Zájemci mohou rovněž navštívit řadu krátkodobých tematických výstav připravovaných podle ročního výstavního plánu. Součástí muzea je rovněž obsáhlá knihovna s významnou regionální a komeniologickou literaturou. Dvakrát ročně je vydáván časopis pro komeniologii, historii 16. – 18. století a regionální dějepis Studia Comeniana et historica. Činnost muzea je dále prezentována především pořádáním krátkodobých výstav, přednášek, oslav Dne učitelů, od roku 1971 pořádáním mezinárodních komeniologických kolokvií a od roku 1998 pořádáním MUSAIONFILMU – každoroční nesoutěžní přehlídky videofilmů muzeí České republiky. V oblasti komeniologie muzeum rovněž úzce spolupracuje na základě smlouvy uzavřené 1. 12. 2004 s Muzeem J. A. Komenského v Naardenu.
Úkolem muzea je soustřeďovat dokumenty o životě a díle J. A. Komenského a umělecká díla všech oborů, mající vztah k činnosti této osobnosti. Rozsah působnosti muzea pokrývá území celé České republiky a muzeum úzce spolupracuje i se zařízeními obdobného charakteru v zahraničí.
Muzeum J. A. Komenského v Uherském Brodě plní své poslání již od svého zřízení také jako specializované muzeum pro historii a národopis Uherskobrodska.